Hortic Res 直播预告 | 用于逐步优化实时 RT-PCR 分析的优化方案

发布时间:2021-09-14联系人:卞越联系方式:13851789902设置

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主讲人

     刘武生,北卡州立大学园艺系助理教授。本科、硕士毕业于东北林业大学,博士毕业于田纳西大学, 并在田纳西大学完成了博士后和助理研究教授的训练和研究工作,出国前曾在北京林业大学从事过四年的教学工作。


    长期从事植物技术、植物合成生物学和基因编辑的研究工作,发表论文28篇,其中1篇被F1000推荐。目前实验室的主要研究方向包括: (1) 不依赖于基因型的、非转基因的、往园艺植物递送CRISPR/Cas9 的新方法研发, (2) 重要农艺性状(比如种子大小和果实番茄红素含量等)的分子机制研究, (3) 用基因工程和基因编辑提高园艺植物性状。所研究的植物主要包括西红柿、亚麻荠(camelina)、沙生蔗茅(Tripidium ravennae)、玫瑰、甘薯、土豆、生菜等,以最大限度确保我们的研究成果能转化到更多的、具有相似性状的园艺植物上。每年春季讲授研究生课程“植物育种的分子生物学”。个人网页:https://cals.ncsu.edu/horticultural-science/people/wliu25/


时间

2021年9月15日 上午9:00-10:30


形式

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本次分享会主要内容

分享会分为两部分:

                    主讲人讲解主要内容+回答问题

主要内容:
用于逐步优化实时PT-PCR分析的优化方案


    实时逆转录PCR(qPCR)方法的准确性在很大程度上取决于引物的特异性、扩增条件的优化、和内参基因的稳定性。qPCR引物在线辅助设计的工具在很大程度上忽略了植物基因组中同源基因序列之间的相似性,可导致研究者因高估了所设计引物的质量而跳过qPCR的优化步骤。然而,qPCR参数的优化对每个基因引物的效率、特异性和灵敏性都起着至关重要的作用。不良的qPCR反应,可能会导致对实验结果的错误解释或实验结果不可重复。

    该分享会将介绍一个易于操作的、系统的、全面优化的qPCR分析方案,该优化方案通过全基因组同源基因序列比对中的SNPs来设计基因特异性引物,逐步优化引物退火温度、引物浓度和最佳模板cDNA质量(μg)范围, 并将效率校准方法和标准曲线方法与2−ΔΔCt方法相结合以得到每个基因的每对引物的cDNA质量(μg)对数和相应的Ct值之间的标准曲线, 目标是得到优化后的qPCR扩增条件以满足每个基因的最优引物对(primer pair)的R2≥0.99和效率 (E) = 100 ± 5% 。此时,就可以利用2−ΔΔCt方法对基因进行相对定量表达数据的分析。作为案例研究,将介绍该优化方案在观赏和能源植物沙生蔗茅(Tripidium ravennae) 和大豆在不同生物或非生物胁迫实验条件下的最优内参基因的鉴定上的应用。