中国植物病害化学防治

杀菌剂三环唑在培养基中不能抑制稻瘟病菌的菌丝生长和孢子萌发，只有在水稻活体组织上才表现对稻瘟病菌有防治活性。因此，测定稻瘟病菌对三环唑的敏感性不能采用常规的测定方法。本文研究了稻瘟病菌对三环唑的敏感性测定及抗药性监测技术。

通过对于7种产孢培养基的产孢能力的比较，结果发现番茄汁培养基所培养的稻瘟菌株的产孢量最大，菌落生长速度较快。通过药剂浸根处理与喷雾处理的比较发现，药剂浸根处理的方法灵敏度高，优于药剂喷雾处理法，药剂浸根36h防效达到最高。活体抗药性测定以3叶1心期稻苗第2、3叶的发病级数为依据计算所获得结果最佳。

研究了稻瘟病菌对三环唑的离体抗药性测定的方法,确定了保绿培养基的成分，建立了离体抗药性监测的标准化模型。4叶1心期稻苗三环唑系列浓度药剂浸根处理，剪取叶段，插于100?g/mL苯并咪唑＋0.5%水琼脂保绿培养基上，10⁵个/mL的稻瘟病菌孢子悬浮液喷雾接种，保湿培养8d后调查结果。该离体测定方法与活体测定法相比较结果更加稳定且灵敏度高，重复性好。

采用离体叶段法就稻瘟菌对三环唑的抗药性进行了测定。共监测采自4个省区的稻瘟菌菌株130份，监测结果表明该4个省区的稻瘟菌对三环唑的敏感性基线为0.35?g/mL，通过监测并未发现抗药性菌株的产生。并就最敏感菌株DY2与最不敏感菌株F6在药剂选择压下进行了筛选，经5代测定，并未发现EC₅₀值有显著升高的现象。通过抗药性测定，可认为目前稻瘟菌对三环唑并未产生抗药性，三环唑在田间可继续安全使用。

通过对三环唑防治稻瘟病应用技术的研究表明，三环唑喷雾、浸根处理都有一定的防效，相同浓度条件下以浸根处理的防效最佳。三环唑浸根或喷雾的药剂持效期为7～10d。经药剂处理3d后再次喷雾处理可以增强防效，延长持效期。三环唑以预防作用为主，兼有一定的治疗作用。药剂的使用时间、水稻叶片伤口的有无、药剂喷雾后短时间内是否有雨水是引起药剂田间防效下降的主要因素。通过药剂复配筛选，发现三环唑·咪鲜胺按一定比例复配可以获得增效的作用。

嘧菌酯是捷利康公司开发的甲氧丙烯酸酯类杀菌剂第一个产品，杀菌活性高且抗病谱广。这类杀菌剂作用于真菌电子传递链的复合物Ⅲ而抑制能量合成，是目前研究最热的一类杀菌剂。然而，这类杀菌剂使用2年后在某些目标真菌中就出现了抗药性，引起人们的普遍关注。2001年，嘧菌酯在中国登记并开始推广应用，所以系统研究嘧菌酯对中国病原菌菌株的生物活性以及抗药性发生的规律和治理策略有重要的现实意义。

作者从田间分离鉴定了14种主要作物的重要病原真菌，测定了嘧菌酯对这14种真菌的生物活性。结果表明，嘧菌酯对大多数植物病原真菌有很强的抗菌活性。嘧菌酯既能抑制菌丝生长又能抑制孢子萌发。测试的14种真菌中，稻瘟病菌、水稻恶苗病菌、水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、黄瓜炭疽病菌、油菜菌核病菌和辣椒红色炭疽病菌菌丝生长对药剂最敏感，EC₅₀为0.0256～5.0618?g/mL；对灰霉病菌和番茄早疫病菌菌丝生长的抑制活性较低，但对它们的孢子萌发有很强的抑制活性，EC₅₀为0.0849～0.5913?g/mL。嘧菌酯对小麦白粉病和黄瓜霜霉病有很好的防效，在温室的活体组织上测定EC₅₀为0.0383?g/mL和0.0428?g/mL。对灰霉病菌分生孢子产生和水稻纹枯病菌菌核产生量有显著的抑制作用；黄瓜炭疽病菌和小麦白粉病菌的致病力丧失或下降。

本论文系统研究了嘧菌酯对稻瘟菌的生物活性。嘧菌酯离体活性受培养基组分影响，可酵解碳源具有拮抗作用。嘧菌酯对稻瘟菌菌丝生长、孢子萌发和产孢量具有强烈的抑制作用，对孢子致病力的影响显著；嘧菌酯对稻瘟菌黑色素合成有抑制作用。甘露醇和SHAM对嘧菌酯抑制菌丝生长的活性不显著，但对抑制孢子萌发的活性具有增效作用。嘧菌酯对稻瘟菌63个菌株的EC₅₀为0.0010～0.0906 ?g/mL，平均EC₅₀为0.0223?g/mL。盆钵试验表明阿米西达具有良好的内吸性；兼有保护作用和治疗作用，且保护作用优于治疗作用。阿米西达对稻瘟菌有一定的田间防效。但随药剂浓度的升高，防效增加不明显，而对水稻增产作用明显。

紫外诱变获得抗嘧菌酯稻梨孢突变体B9-R2，此突变体对嘧菌酯表现高抗药水平。突变体子代抗药性状稳定，但是随着转代和长期低温培养，抗药水平下降，生长速率降低。抗药突变体产孢能力、孢子萌发能力下降。抗药突变体毒素产生、黑色素产生能力和致病力与敏感菌株相同。嘧菌酯不能抑制抗药突变体的黑色素产生，在活体条件下嘧菌酯对突变体的控制活性较弱。此突变体抗药机制不可能是旁路氧化酶的作用。

16个辣椒炭疽病菌菌株对嘧菌酯的敏感性差异很大。NJR菌株（红色炭疽）对嘧菌酯的EC₅₀为0.2185?g/mL；而NJB（黑色炭疽）对嘧菌酯不敏感，100?g/mL嘧菌酯对NJB的抑制率只有37.2%。在测试的几种药剂中，NJR、NJB对多菌灵最敏感。嘧菌酯与多菌灵、百菌清、福美双和代森锰锌以不同比例复配，其复配剂对NJR和NJB两个菌株的毒力有差异。嘧菌酯与多菌灵不同比例复配，对NJR和NJB两个菌株均表现为加和作用。嘧菌酯与百菌清一定的比例复配，对NJR的抑制表现为拮抗作用，而对NJB的抑制表现为增效作用。对NJR，嘧菌酯与福美双以各比例复配都没有增效作用；而对NJB，混剂均有增效作用。嘧菌酯与代森锰锌混剂（1：1、1：3和1：9）对NJR表现为增效作用；而以各比例复配对NJB菌株均表现为增效作用。

四种植物病原真菌对多菌灵的抗药性分子遗传机制及其检测技术的研究

李红霞

（南京农业大学农药科学系）

苯并咪唑类杀菌剂作为一类高效、广谱内吸性杀菌剂在生产上应用，解决了保护性杀菌剂的环境毒性问题，同时也降低了对用药技术和用药时间的要求，提高了病害的防效。由于这类药剂的高度专化性，作用位点单一，加上施用频率高，使用2~3年后许多植物病原真菌很快会出现抗药性问题。苯并咪唑类杀菌剂是通过与病原菌β-微管蛋白结合，抑制微管的功能，阻止细胞的有丝分裂，抑制病原菌生长。病原菌抗药性的产生是因为细胞中β-微管蛋白由于控制该蛋白的基因发生突变，使蛋白三维构象改变，从而失去了与药剂分子的亲和性。近年来大量研究证明，除引起马铃薯储藏期干腐病的Gibberella pulicaris外，β-微管蛋白基因的198或200位氨基酸密码子的点突变是导致大多数病原菌产生抗药性的主要原因。

核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、禾谷镰孢霉（Fusarium graminearum）、炭疽菌（Colletotrichum gloeosporiodies）和葡萄孢霉（Botrytis cinerea）引起的多种作物炭疽病和灰霉病是中国常见的重要农作物和蔬菜病害。长期以来对这4种病害的防治主要采用苯并咪唑类或与不同作用机制药剂复配的杀菌剂。1987、1992和1996年在田间分别检测到B.cinerea、F. graminearum和S. sclerotiorum对多菌灵的抗药性菌株。

通过室内菌落直径法测定这四种植物病原真菌对苯并咪唑类杀菌剂和乙霉威的敏感性。结果表明，小麦上 F. graminearum的敏感菌株（MBC^S）对多菌灵（MBC）的EC₅₀值小于1μg/mL，无论是田间或诱导抗性菌株（MBC^R）的EC₅₀值均在10μg/mL左右，MBC^R菌株与乙霉威（NPC）间不存在负交互抗药性。2002年采集、分离获得江苏省通州市4乡镇油菜上的223个S. sclerotiorum菌株，对MBC和NPC的敏感性测定得到2种表型，其中143个菌株表现对多菌灵敏感而对乙霉威高抗（MBC^SNPC^HR），其余80个菌株表现对多菌灵高抗而对乙霉威敏感（MBC^HRNPC^S），且MBC^HRNPC^S菌株对7~28℃温度范围不敏感。2002年采集、分离获得江苏省江阴市番茄上的14个B.cinerea菌株，对MBC和NPC的敏感性测定得到2种表型，其中2个菌株表现MBC^SNPC^HR，其余12个菌株表现MBC^HRNPC^S。2001年从江苏省盐城地区采集分离到辣椒上的17个C. gloeosporiodies菌株，其中1个MBC^HRNPC^S菌株、1个MBC^LRNPC^R菌株和15个MBC^SNPC^HR菌株。

本研究通过根据其他相关真菌β-微管蛋白的保守序列合成的3对兼并性引物扩增获得F. graminearum、S. sclerotiorum、B.cinerea与抗多菌灵相关的β-微管蛋白全基因，通过其中的1对兼并性引物B1和B3获得了C. gloeosporiodies β-微管蛋白基因的部分序列。其中F. graminearum的β-微管蛋白基因全长1631bp，包含3个内含子，编码447个氨基酸，与其他病原线状真菌除内元数目不同外，具有高度同源性，氨基酸同源性达95.12%~99.30%。S. sclerotiorum的β-微管蛋白基因全长1685bp，包含4个内元，相应的编码447个氨基酸，氨基酸序列同源性达95.78%~97.66%。B.cinerea的β-微管蛋白基因全长1765bp，包含6个内元，相应的编码447个氨基酸，与S. sclerotiorum和F. graminearum β-微管蛋白基因的氨基酸序列同源性分别为97.76%和96.20%。C. gloeosporiodies β-微管蛋白基因的部分序列长586bp，包含1个内元（55bp），其位置与模式菌粗糙麦孢霉(Neurospora crassa)的内元6一致。与HS1（MBC^S黑色炭疽）相比，炭疽菌中的HGS2（MBC^S红色炭疽）、YC8（MBC^LR）、YC41（MBC^HR）；禾谷镰孢菌 ZF2054（MBC^R）；核盘菌TZ25（MBC^HR）；灰葡萄孢CGY001（MBC^HR）的同源性分别为100%、97.18%、98.31%、98.87%、96.61%、98.87%。

F. graminearum 的MBC^S和MBC^R菌株核苷酸序列分析表明，MBC^R菌株未发生任何位点的突变，说明F. graminearum对多菌灵的抗药性机制并非像其他丝状真菌一样由β-微管蛋白198位氨基酸突变所致。S.sclerotiorum、B.cinerea和C. gloeosporiodies的β-微管蛋白基因编码的198位氨基酸残基的GAG谷氨酸（Glu）突变为GCG丙氨酸（Ala）是导致上述病原菌产生对多菌灵高度抗药性的主要原因；突变位点和突变类型与其他抗多菌灵真菌一致，且与乙霉威之间存在明显负交互抗性。C. gloeosporiodies的MBC^LRNPC^R菌株198位氨基酸未发生突变，尽管对四种病原真菌7个菌株的β-微管蛋白进行比较发现，除198位氨基酸外，其他位点也有所变化，那是属于菌株间的差异，但198位氨基酸的突变则是导致田间病原真菌产生高度抗药性的直接原因。

为了快速、准确检测和监测S.sclerotiorum的田间抗药频率，根据MBC^HR菌株的点突变设计了2个快速检测方法：第一种方法是根据MBC^HR菌株197和198位密码子（GACGAG→GACGCG）形成ThaI酶切位点（3’CGCG 5’），将B1/B3的扩增产物874bp片段酶切成193bp和681bp片段，而MBC^S菌株的PCR产物不被酶切；第二种方法用198位突变密码子作为3’末端碱基设计2对等位基因特异性寡核苷酸引物（ASO）用于“nested”PCR或直接从菌丝基因组DNA扩增。引物对S-TR/SS-1只能从MBC^HR菌株中扩增出373bp的条带，而引物对S-TS/SS-1只能从MBC^S菌株中扩增出373bp的条带。通过PCR扩增和ThaI酶切能直接检测S.sclerotiorum的MBC^HR和MBC^S菌株，所得结果与传统菌落直径法相吻合。进一步简化基因组DNA的提取过程，改用直接从菌核中提取，再以此为模板扩增，所需时间约为6h，检出率为100%，与传统菌丝直径法的测定结果相比检测准确率为96%，而改进前的检测方法至少需要1~2周。而本研究用点杂交和单链构象多态性(SSCP)则不能明显区分S.sclerotiorum中的MBC^HR和MBC^S菌株，需要进一步优化条件。

玉蜀黍赤霉（Gibberella zeae）对多菌灵的抗药性遗传研究

袁善奎

（南京农业大学农药科学系）

本文以抗多菌灵及野生敏感型禾谷镰孢霉（Fusarium graminearum）菌株为材料，在含2.5%KClO₃的MMC培养基上培养，获得了不能利用硝酸盐的营养缺陷突变体（Nitrate nonutilizing mutant，简称nit突变体），分别属于4种不同的生理突变型，即nit1、nit3、NitM、nitA。比较了各nit突变体与其亲本菌株之间在菌落生长速率、培养性状、产分生孢子能力、产子囊壳能力以及对多菌灵的敏感性等生物学特性方面的差异，并研究了nit特性在自交和无性繁殖过程中的遗传稳定性。结果表明，nit突变体均抗氯酸盐，在PSA平板上的生长速率没有改变，有性生殖能力没有下降，在Joff’s 培养液和5%绿豆汤培养液中仍能产孢，虽然产孢能力与亲本菌株有差异，但与nit突变无关；nit突变特性在自交和无性繁殖过程中能够稳定遗传；此外，禾谷镰孢霉对氯酸盐和多菌灵之间没有交互抗药性。因此，可用nit作为遗传标记，研究具同宗配合特性的禾谷镰孢霉对多菌灵的抗药性在有性重组过程中的遗传与变异。

根据在0.5、1.4、50、100μg/ml等不同浓度的含药PSA平板上能否生长，将禾谷镰孢霉田间菌株对多菌灵的敏感性划分为：敏感（S）、中抗（MR）和高抗（HR）等3个水平，其中S菌株在0.5μg/ml浓度下能生长，但在≥1.4μg/ml浓度下生长受到完全抑制；MR菌株在1.4μg/ml浓度下能快速生长，在50μg/ml浓度下能缓慢生长，但在≥100μg/ml浓度下不能生长；HR在≥100μg/ml浓度下仍能生长。没有发现在1.4μg/ml浓度下能快速生长，而在50μg/ml浓度下能被完全抑制的田间抗性菌株。禾谷镰孢霉对多菌灵的敏感性在自交和无性繁殖过程中能够稳定遗传。从25个敏感菌株和31个抗性菌株中随机挑选了2个S、3个MR和1个HR，并以硝酸盐营养缺陷型突变体（nit）作为另一个遗传标记，按照S×S、MR×MR、MR×S、HR×S、HR×MR等共设计了7个杂交组合，对各杂交后代对多菌灵的敏感性测试发现，在所有杂交后代中均未出现除双亲表现型以外的重组型个体，MR×S、HR×S及HR×MR的杂交后代出现了1∶1的分离比例，且抗药基因与不同生理型的nit突变基因间无连锁关系，在后代中各自独立分离。以上结果表明禾谷镰孢霉田间菌株对多菌灵的抗药性是由单个孟德尔基因控制的，不同水平的抗药性由同一等位基因控制，该基因的不同碱基位点发生突变或同一碱基位点发生不同的突变可导致不同的抗性水平，抗药性不受修饰基因或胞质遗传因子的影响。

通过紫外线（UV）照射和药剂选择的方法均获得了禾谷镰孢霉野生敏感菌株对多菌灵的室内抗药突变体，这些抗药突变体一部分表现低抗（LR），即能在致死临界剂量1.4μg/ml多菌灵浓度下生长，但不能在10μg/ml浓度以上生长，且对二氯苯胺甲酸甲酯(MDPC)不具负交互抗药性；另一部分表现高抗（HR），即能在100μg/ml多菌灵浓度下生长，并与田间高抗菌株一样，对MDPC具有负交互抗药性；没有获得类似田间的中抗（MR）菌株，即能在10μg/ml多菌灵浓度下快速生长，50μg/ml浓度下缓慢生长，但不能在100μg/ml浓度以上生长。通过药剂选择的方法也获得了田间中抗菌株（MR）的高抗突变体（HR），但这些突变体对MDPC与MR一样仍然不具负交互抗药性。在所研究的抗药突变体中，抗药性在自交和无性繁殖后代中能稳定遗传，且抗药突变体具有致病性。抗药突变体对多菌灵和MDPC的抗药性遗传研究表明，室内抗药突变体和田间抗药菌株对多菌灵的抗药性由同一个主效基因控制，但它们发生突变的碱基位点不同或者同一碱基位点发生了不同的突变，因此禾谷镰孢霉对多菌灵的抗性属于复等位基因抗性（multiple allelic resistance）；对MDPC的敏感性的增加也是由单个基因控制的，但这种突变方式能使病菌对多菌灵产生高度抗药性。

关键词：玉蜀黍赤霉（Gibberella zeae）；nit突变体；多菌灵；抗药性；遗传

阿米西达防治黄瓜白粉病的技术研究

谢标洪

（南京农业大学农药科学系）

甲氧丙烯酸酯类杀菌剂是一类具有新颖作用机制的新型杀菌剂。本文研究了瓜类白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea)对阿米西达的敏感性基线、抗药性监测方法和对黄瓜白粉病的防治技术。

采用了小株喷雾法、叶盘沾药漂浮法、叶盘漂浮法、叶盘沾药法和海绵垫叶盘漂浮法等五种抗药性监测方法，就中国部分地区瓜类白粉病菌对阿米西达的敏感性进行研究。测得小株喷雾法、叶盘沾药漂浮法、叶盘漂浮法、叶盘沾药法和海绵垫叶盘漂浮法其EC₅₀分别是0.02μg/ml、0.00467μg/ml、0.00756μg/ml、0.0709μg/ml和0.1675μg/ml，表明叶盘沾药法最灵敏，叶盘漂浮法次之，但叶盘漂浮法简便易行，适合大规模菌样测定。三次叶盘漂浮法EC₅₀值分别为0.00775μg/ml、0.00756μg/ml和0.00780μg/ml，说明叶盘漂浮法的重复性好。用叶盘漂浮法测定了未接触过药剂的60株黄瓜白粉菌株对阿米西达的敏感性，EC₅₀值介于0.00065μg/ml~0.0119μg/ml，平均EC₅₀为0.00305μg/ml，以此为黄瓜白粉病菌对阿米西达的敏感性基线。

阿米西达对瓜类白粉病防治效果优异，用药量低，持效期长，使用安全。比目前常用高效药剂腈菌唑的效果更好，剂量更少。叶盘漂浮法测定结果表明，阿米西达对瓜类白粉病的毒力比腈菌唑更强，阿米西达的EC₅₀值为0.00775μg/ml，腈菌唑的EC₅₀值为0.0102μg/ml。保护效果测定结果表明，阿米西达有效成分0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、3.0μg/ml对黄瓜白粉病的防效为64.33%~87.42%，而对照药剂腈菌唑2.0μg/ml的防效为55.97%；由治疗效果结果可知，接种48小时后喷阿米西达2.0μg/ml、3.0μg/ml的防治效果为88.0%~92.5%，而腈菌唑2.0μg/ml的防治效果为39.9%；接种96小时后喷阿米西达2.0μg/ml、3.0μg/ml的防治效果为69.6%~85.7%，而腈菌唑2.0μg/ml的防治效果为25.1%。本研究结果表明，阿米西达作为防治瓜类白粉病的高效药剂，可与腈菌唑等其它药剂交替使用。

田间试验结果表明，25%阿米西达60μg/ml~120μg/ml对黄瓜白粉病有优异的防治效果，其中尤以120μg/ml的防治效果最佳，差异显著性测验表明，25%阿米西达90－120μg/ml的防治效果与对照药剂17%腈菌唑30μg/ml的防治效果差异显著。

关键词：瓜类白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea)；阿米西达；使用技术