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植物病原菌抗药性遗传研究综述袁 善 奎
（南京农业大学农药科学系）
返 回1.植物病原菌抗药性遗传类型
植物病原菌的抗药性可以由染色体基因或胞质遗传基因的突变产生，因此，可以将植物病原菌的抗药性分为核基因（nuclear gene）控制的抗药性和胞质基因(cytoplasmic gene)控制的抗药性。植物病原真菌对大多数杀菌剂的抗性属于前一种情况；而存在于细胞质中的抗药基因，目前已知的主要位于真菌的线粒体和细菌的质粒中，真菌对少数药剂的抗药基因和细菌的抗药基因属于这种情况。
对于核基因控制的抗药性，又可以分为主效基因（major-gene）抗药性和聚基因（polygenic）抗药性。其中主效基因抗性又可分为单个主效基因控制的抗性，即单基因（single-gene）抗性，和多个主效基因控制的抗性，即多基因（multi-gene）抗性。对于单基因抗性，通常存在一种复等位基因抗性（multiple allelic resistance）的情况，即该基因座位（locus）上不同的碱基位点（sites）可以分别发生突变或同一碱基位点可以发生不同的突变，并能使病菌表现出不同的抗性水平，如灰霉病菌（Botrytis cinerea）、苹果黑星病菌（Venturia inaequalis）等对苯并咪唑类杀菌剂的抗性。在多基因抗性中，其中的任何一个主效基因的突变都会使病菌产生抗性，如在粗糙链孢霉（Neurospora crassa）中有6个主效基因控制对二甲酰亚胺类杀菌剂的抗性，其中任何一个基因发生突变都可产生抗性。但当有两个或两个以上的主效基因同时发生突变时，存在两种情况，一是某一主效基因会对其他主效基因具有上位显性作用，即抗性水平与该主效基因单独突变时一致；另一种情况是主效基因间会发生互作，从而使得抗性水平不同于单一主效基因发生突变，如在尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）中，对苯来特的高水平抗性是由两个主效基因的互作引起的。但无论在什么情况下，只要是主效基因控制的植物病原菌抗药性，田间病原群体或敏感性不同的菌株杂交后代对药剂的敏感性都呈明显的不连续性分布，很容易识别出抗药群体。
聚基因抗性是指抗性由多个微效基因控制，且这些基因间具累加效应，即单个或少数基因的突变引起的抗性水平是微不足道的，病菌对药剂高水平抗性的产生需要多个基因的突变。由于不同抗药菌株中所携带的抗药基因数目的差异，使得整个病原群体或敏感性不同的菌株的杂交后代对药剂的敏感性呈连续性分布，这也是区别于主效基因所控制的抗药性的基本特征。
抗药性遗传与病原菌的其他遗传性状一样，也有质量性状与数量性状之分。主效基因控制的抗药性为质量性状，存在抗药性的病原菌杂合群体对药剂的敏感性呈明显的不连续性分布，由于敏感性没有重叠，因此抗性和敏感的群体可以很明显的区分开；而聚基因控制的抗药性为数量性状，不同菌体内抗药基因数目的差异，使得病原群体对药剂的敏感性呈连续性分布。抗药性由胞质基因控制的病原菌群体对药剂的敏感性通常也呈不连续性分布，表明这类抗药性状也是质量性状的。
2.胞质基因控制的抗药性（Cytoplasmic gene control of resistance）
目前已知许多细菌的抗药基因主要存在于质粒DNA分子中，过去仅发现酵母对三烷基锡（trialkyltin）类药剂（干扰病菌的氧化磷酸化过程）的抗药性是由线粒体DNA分子控制的。许多药剂尽管是干扰真菌的线粒体活性，但真菌对这些药剂的抗性也是由核基因控制的。近年来研究发现病原菌对作用于菌体细胞色素bc1复合物的QoIs类药剂的抗药性也是由线粒体基因控制的。
2.1 铜制剂（copper）
铜制剂在很早以前就被用来防治细菌病害。尽管在室内可以获得染色体基因发生突变的细菌对铜制剂的抗药突变体，但田间抗性菌株主要是质粒DNA分子突变引起的，主要包括两种类型的质粒，其中一类是只在辣椒疮痂病菌中发现的pXcv型质粒；另一类包括在于番茄细菌性斑点病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato）中带有cop操纵子的质粒及一些存在于Pseudomonas spp.和X. compestris pv.vesicatoria 中带有抗性相关基因的质粒。
尽管铜制剂也被广泛用于防治马铃薯晚疫病（Phytophthora infestans）和葡萄霜霉病（Plasmopara uiticola）等真菌病害，但没有因抗性问题导致田间防治失效的报道。
2.2 链霉素(streptomycin)抗性
早在1962年，Stall等就报道了在美国Florida 的辣椒疮痂病菌对链霉素的田间抗药性。Burr等研究发现，从苹果树上分离到的所有抗链霉素的苹果疱斑病菌（P. syringae pv. papulans）菌株中都有一个敏感菌株中所没有的103kb的pCPP501质粒。在辣椒疮痂病菌中，链霉素抗性基因主要存在于一些大小不等的质粒中，也可能还有一些别的抗性相关基因。
链霉素除对细菌病害有效外，还对一些由卵菌引起的病害有效。Shaw等通过室内诱导获得了恶疫霉（P. cactorum）对链霉素的抗药突变体，其中一个突变体需要链霉素才能生长，抗性及对链霉素的依赖性在无性和有性繁殖过程中能稳定遗传，但这是由染色体因子还是胞质遗传因子控制的还不清楚。Chang 等对寄生疫霉（P. parasitica）的研究表明，链霉素抗性是由胞质遗传因子决定的，属母性遗传。
2.3 QoIs类药剂（Qo respiration inhibitors）
QoIs类杀菌剂是一类作用于病原菌线粒体中电子传递链上cyt-bc1酶复合物Qo中心的一类药剂，主要包括甲氧丙烯酸酯类的嘧菌酯（azoxystrobin）、苯氧菌酯（kresoxim-methyl）、苯氧菌胺（metominostrobin）、肟菌酯（trifloxystrobin）、啶氧菌酯（picoxystrobin）、pyraclostrobin（BAS500F）等和恶唑烷酮类的恶唑菌酮（famoxadone）、咪唑菌酮（fenamidone）等药剂。1998年，在德国北部田间检测到抗QoIs药剂的小麦白粉病菌，为首例植物病原菌对这类药剂的田间抗性。与大多数杀菌剂不同，这类杀菌剂的作用靶标cyt-bc1是由线粒体DNA编码的，而不是由核DNA编码的。由于线粒体遗传是母性遗传，所以只有抗性基因存在于母本时，抗性表型才能在后代中表现出来，即母本为R时，R×S杂交后的分离模式是1R：0S；而父本为R，R×S杂交后代全为S，抗性在后代中丧失。在梨黑星病菌R×S的杂交中，随机挑选的44个单子囊孢子后代全部为S；Ziogas等在室内通过化学诱变获得了玉米黑粉病菌对嘧菌酯的抗药突变体，遗传学研究发现，抗药性在这些突变体与野生敏感菌株的杂交后代中表现非孟德尔遗传，说明抗性也是由胞质基因控制的。分子遗传学研究表明，病菌对这类药剂的抗性主要是在cyt b基因的127~147和275~296两个区段的某一碱基发生点突变引起的。
2.4 其他
在研究一些室内诱导的抗药突变体的过程中发现，抗药性在无性繁殖或自交后代中不稳定，抗性逐渐丧失。因此推断在这些抗药突变体中抗性也是由胞质遗传因子控制的，如苎麻疫霉（P. boehmeriae）对霜脲氰和甲霜灵的室内诱导抗性，但没有关于该菌的田间抗药菌株对这两种药剂的抗药性遗传研究的报道。
3.细胞核基因控制的抗药性（nuclear gene control of resistance）
3.1 主效基因控制的抗药性（major gene control of resistance）
3.1.1苯并咪唑类（benzimidazoles）杀菌剂
该类杀菌剂主要包括苯莱特（benomyl）、多菌灵（carbendazim）等，是一类非常重要的内吸性杀菌剂。目前已有至少55个属的病原菌对这类杀菌剂产生了抗药性。已发现大多数病菌对这类药剂的抗性是由单个染色体基因的突变引起的，如Botrytis cinerea、洋榆枯萎病菌（Ceratocystis ulmi）、N. crassa、Physarum polycephalum、玉米黑粉病菌（Ustilago maydis）、V. inaequalis、V. nashicola、V. pyrina等。一方面该基因上不同碱基的突变常常使病菌表现出不同的抗性水平，如B. cinerea、V. inaequalis等对这类药剂的抗药性；另一方面，该基因上部分碱基的突变使得病菌对苯并咪唑类药剂产生抗性的同时，对N-苯氨基甲酸酯（N-phenylcarbamates）类药剂（如乙霉威、MDPC等）、N-phenylformamidoxims及N-phenylanilines等表现负交互抗性，如B. cinerea、Venturia spp.等对苯并咪唑类药剂的高抗菌株。
虽然大多数病菌对苯并咪唑类药剂的抗性是由单个主效基因控制的，但也有例外，如在尖孢镰刀菌（F. oxysporum）和意大利青霉（Penicillium italicum）中，高水平的抗性是由两个主效基因的协同互作引起的；Stover等发现在香蕉黑叶条斑菌（Mycosphaerella fijiensis var. difformis）和香蕉褐缘灰斑病菌（M. musicola）中，除染色体基因外，一些胞质因子也与抗性有关。
苯并咪唑类杀菌剂主要通过与病菌的?-微管蛋白结合来发挥其抗菌效果。分子生物学研究表明，?-微管蛋白上氨基酸的改变与抗药性的产生有关。在抗性菌株中，?-微管蛋白198位和200位氨基酸发生了改变，在人工诱变的抗药突变体中除上述位点外还涉及到其他一些位点如165、257等位点氨基酸的改变。但有报道玉蜀黍赤霉（Gibberella zeae）和马铃薯干腐病菌（G. pulicaris）对苯并咪唑类药剂的抗性菌株的?-微管蛋白基因并没有发生改变，说明在不同病菌中对该类药剂发生抗药突变的位点存在差异。
3.1.2 芳烃类药剂（aromatic hydrocarbon group）
主要包括地茂散（chloroneb）、五氯硝基苯（quintozene）、二甲酰亚胺类（dicarboximide）类杀菌剂、甲基立枯磷（tolclofos-methyl）以及吡咯苯（phenylpyrrole）类杀菌剂等， 由于这些药剂具有交互抗性，且都对病菌的有丝分裂有不同程度的影响，因此有时将它们都归入芳烃类药剂进行讨论。已证明构巢曲霉（Aspergillus nidulans）对甲基立枯灵的抗性、B. cinerea对吡咯苯类杀菌剂的抗性和对二甲酰亚胺类药剂的抗性、N. crassa对二甲酰亚胺类药剂的抗性、P. parasitica和U. maydis]对地茂散的抗性、Hypomyces solani对氯硝基苯类药剂（chlorinated nitrobenzenes）的抗性等几乎都是主效基因控制的。
3.1.3 羧基酰胺（carboximides）类化合物
这类杀菌剂有萎锈灵（carboxin）、氧化萎锈灵（oxycarboxin）、邻酰胺（mebenil）等，主要抑制病原菌的琥珀酸脱氢酶活性。在A. nidulans中，对氧化萎锈灵的抗性是由3个主效基因控制的；U. Maydis对萎锈灵的低水平的抗性是由ants基因的突变引起的，根据这个基因对氰化物的不敏感性很容易将这个基因识别出来] ，而中抗和高抗是由oxr-1基因的两个等位基因突变引起的，对高抗基因（oxr-1B）的研究发现，与很多生物中编码琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白亚单位的基因的同源性非常高，在敏感菌株与抗性菌株中该基因存在两个碱基的差异，使得在抗性菌株中编码的His残基取代了敏感菌株中的Leu残基；在大麦散黑穗病菌（U. nuda）中，对萎锈灵的抗性也是由单个主效基因控制的。
3.1.4苯酰胺类化合物（phenylamides）
这类杀菌剂如甲霜灵(metalaxy)、肤霜灵（furalaxyl）等，主要对卵菌病害有效，由于卵菌为二倍体致病真菌，因此相对那些单倍体致病菌来说，抗药性遗传背景就更为复杂。但对莴苣霜霉病菌（Bremia lactucae）、致病疫霉（P. infestans）和寄生疫霉（P. parasitica）等的研究发现，对苯酰胺类杀菌剂的抗性是由单个主效基因控制的。在莴苣霜霉病菌和致病疫霉 中，抗性基因为不完全显性，所以高抗菌株与敏感菌株杂交的F1代为中抗，在F2代中出现敏感：中抗：抗性=1：2：1的分离比例。而在寄生疫霉中抗性则是完全显性的。
3.1.5春日霉素(kasugamycin)
春日霉素于1965年在日本作为汞制剂的替代药剂被广泛用于稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）的防治，主要影响病菌的蛋白质合成，但在1971年就出现了抗药性问题。Taga等将田间抗性菌株与野生敏感菌株杂交，并分析了后代对该药剂的敏感性，发现在后代中只包含双亲的两种抗性表型，因此认为抗性是由主效基因控制的。进一步研究发现，在稻瘟病菌中有3个主效基因kas-1、kas-2和kas-3与对春日霉素的抗性有关，其中kas-3基因的突变能使病菌同时对另一防治稻瘟病的抗生素灭瘟菌素（blasticidin S）表现正交互抗性，但这3个基因不存在连锁关系和积加效应，仍何一个基因的突变均会导致抗性的产生，因此为多基因抗性。
3.1.6其他
对于出现抗性问题的某一“病菌-药剂”组合而言，即使没有研究其抗药性的遗传规律，但田间群体中如果包含了两个或多个敏感性明显不同的没有重叠的亚群体，就可以推测该病菌对此类杀菌剂的抗性是由主效基因控制的。如在日本，1967年开始使用多氧霉素（polyoxins）防治梨黑斑病菌（Alternaria kikuchiana），该药剂主要影响病菌的几丁质合成，在1971年突然出现了田间防治失败，但由于梨黑斑病菌在室内和田间均不能形成有性时期，因此没有有关抗药性遗传研究的报道。根据高水平的抗药性突然发生并在田间很快导致防治失败这一现象，且抗性菌株与敏感菌株对药剂的敏感性没有重叠，可以推断对此药剂的抗性也是由主效基因控制的。
3.2聚基因控制的抗药性（poly-gene control of resistance）
3.2.1多果定（dodine）
多果定主要干扰病菌的细胞膜透性和抑制呼吸作用。在Nectria haematococca var. cucurbita中首次研究了对多果定的抗药性遗传，已发现有4个位点与抗性有关，且在重组体中具有积加效应，因此抗性是由聚基因控制的。另外，在V. inaequalis中，根据遗传学的研究以及田间群体对药剂敏感性呈连续性分布，认为对多果定的抗性也是由聚基因控制。
3.2.2甾醇C-14脱甲基抑制剂
这类杀菌剂主要作用于病原菌甾醇生物合成过程中的C-14脱甲基酶，称为甾醇C-14脱甲基抑制剂，简称DMI(demethylation inhibitors)类药剂。病原菌对这类杀菌剂的抗性是聚基因抗性的证据来自两个方面，一是田间随机采集的野生病菌群体对药剂的敏感性呈连续性分布，如苹果黑星病菌对氟硅唑的敏感性、小麦白粉病菌对三唑酮的敏感性分布等;再就是抗性菌株与敏感菌株杂交后代对DMI药剂的敏感性也呈连续性分布，如大麦白粉病菌对三唑醇的抗性。已证明在A. nidulans、N.haematococca var. cucurbitae、大麦白粉病菌（Erysiphe graminis f.sp. hordei）、U.maydis]等几种菌中对DMI类杀菌剂的抗性是由聚基因控制的。但也有报道病菌对某些DMI类杀菌剂的抗性是由单基因控制的。
根据目前的证据可以认为对DMI类杀菌剂的抗性通常是由聚基因控制的，但在部分病原菌中对某些DMI类杀菌剂的抗性是由单个主效基因控制的。对DMI类杀菌剂的聚基因抗性的最重要的证据是在使用DMI类杀菌剂防治E. graminis f.sp. hordei多年的田块没有发现对药剂的敏感性呈不连续性分布的群体。
3.2.3吗啉（morpholines）类药剂
这类药剂也作用于病菌甾醇的生物合成，但作用靶标不同于DMI类药剂，主要作用于?14-还原酶和?8→?7异构化酶，因此病菌对DMI类杀菌剂的抗性的突变不会改变对吗啉类药剂和哌啶类药剂等这些对C-14脱甲基步骤没有影响的药剂的敏感性。虽然DMI类药剂在田间使用不久就检测到抗药菌株，但吗啉类药剂使用至今没有因抗性导致田间防效下降的报道，许多有关吗啉类药剂抗性遗传的报道都是以室内诱导的抗药突变体为材料。如在N. haematococca var. cucurbitae和var. pisi中，对诱导的丁苯吗啉的抗药突变体的研究发现，都有3个与抗性有关的基因，而且具有累加效应，因此认为对该药剂的抗药性是聚基因抗药性。
3.2.4乙菌啶（ethirimol）
乙菌啶系羟基嘧啶（hydroxypyrimidine）类药剂，主要用于种子处理防治禾谷类作物的白粉病，但很快就出现了抗药性问题。药剂防治后存活下来的病菌群体对药剂的敏感性有轻微的下降，且敏感性的分布呈连续性分布，这表明抗药性是由聚基因控制的。田间不同敏感性菌株的杂交后代对药剂的敏感性呈一个连续性的分布也说明抗药性是由聚基因控制的。Brown等的研究结果却相反，他们认为对该药剂的抗药性是由单个基因控制的，但也不能排除聚基因抗药性的可能，除非与其它基因不具有累加效应。
3.2.5 其他
病原菌对有些药剂的抗药性缺乏遗传学研究，但如果发现田间病菌群体对药剂的敏感性呈连续性分布，就可以推断抗药性也可能是由聚基因控制的，如稻瘟病菌对有机磷类（phosphorothiolates）杀菌剂的敏感性及甜菜褐斑病菌（Cercospora beticola）对三苯锡（triphenyltin）的敏感性等。
4.抗药性遗传研究的意义
（1）为预测抗药病原生理小种的群体发展动态和制定抗性治理策略提供依据：
在一个已经对药剂产生抗性的病原群体中，包含了两个亚群体，即抗药生理小种和野生敏感生理小种。抗药生理小种可从最初的个体或小群体发展成为病原菌的优势致病群体。在影响病菌抗药群体发展的诸多因素中，抗药性遗传背景起着至关重要的作用。
有关胞质基因控制的田间抗药群体发生规律的报道较少，但近年来开发的QoI类药剂属于这种抗药性遗传类型，尽管这类药剂最初被认为是中等抗性风险的药剂，但已报道在德国使用苯氧菌酯防治小麦白粉病菌（E. graminis f.sp. tritici）仅两年就发现防治效果下降，随后在使用这类药剂防治大麦白粉病菌（E. graminis f.sp. hordei）和葡萄霜霉病菌（Pseudoperonospora viticola）等2~3年后也在田间检测到抗药菌株，表明这种类型的抗药群体在田间发展速度也较快。因为对这种类型的抗药性，病原群体对药剂的敏感性通常也呈明显的不连续性分布，类似主效核基因控制的抗药性。
对主效基因控制的抗药性，田间一旦出现抗药个体，由于药剂对抗药病菌几乎无效，因此在药剂的选择压力下，抗药亚群体在整个病原群体中的比例会很快上升，短时间之内就有可能失去防效。通常情况下，只有当抗性菌株的频率达到1%~10%时才能被检测出来，而这时采取措施已经为时过晚，因此针对这种抗药类型的“药剂-病原菌”组合，应尽早采取抗性治理措施，延缓抗性产生。当然，主效基因控制的抗药性不一定总会导致防效很快失败，这一方面取决于抗药菌株在自然条件下的适合度，但在通常情况下，抗性菌株的适合度与敏感菌株并没有明显差异，如苯并咪唑类药剂和苯酰胺类药剂的抗药菌株；另一方面，还与病原菌对该药剂抗药的自然突变频率有关，如果突变频率高，则在田间很快就会出现抗性个体，并在药剂的选择压力下，不断发展成为为抗药亚群体，反之，田间抗药性问题发生就相对较晚。
对聚基因控制的抗药性，短时间内药剂不会很快失去防效，抗性发生初期，增加药量或防治次数可能会达到防治效果，但整个病原群体对药剂的敏感性会朝着敏感性降低的方向移动，不敏感群体不断上升，敏感群体不断减少甚至消失。
（2）为预测新药剂在田间的使用寿命提供依据：
Georgopoulos等认为了解病菌对某一药剂的抗药性的遗传类型对预测该药剂的田间使用寿命非常重要。如果病原菌对某一新药剂的抗药性是由胞质基因或主效核基因控制，则可以预测病原菌在田间很容易对该药剂产生抗药性，在药剂使用初期就应该与不同作用机制的药剂混用或者轮换使用，从而延长该药剂的田间使用寿命；如果早期研究发现抗药性是由聚基因控制的，则可以预测病原群体对该药剂的田间抗性发展较慢，短期内不会因抗药性导致田间防治失败。
（3）为抗药性分子机制的研究提供参考：
抗药性遗传的研究可以了解控制抗药性的基因数目，从而为抗药性分子机制的研究指明方向；另外，可以通过遗传研究了解抗药基因与其它一些遗传标记基因间的连锁关系，如果能找到一个与抗药性紧密连锁的性状，且控制该性状的基因已知，那么就会很容易克隆出抗药基因。因此，抗药性遗传与抗药性分子机制的研究是相辅相成的，它们的研究结论还可以相互验证。
（4）可丰富该病原菌遗传学研究的内容并为研究其它性状的遗传与变异提供遗传标记：
对某一病原菌抗药性遗传的研究也是该菌遗传学研究的重要内容，对了解该菌的遗传变异规律具有重要的意义。另外，抗药性可作为遗传标记被应用于无性重组中融合子的筛选、有性杂交过程中重组个体的筛选及分子生物学研究中遗传转化的选择性标记和报告基因等，而且抗药遗传标记比常用的营养缺陷型标记的诱导和鉴定更加容易。
主 办：中国植物病理学会化学防治专业委员会
copyright:南京农业大学杀菌剂研究室
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