中国植物病害化学防治

随着分子生物学技术的发展，检测鉴定基因变异的方法不断涌现。尤其是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术问世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因变异研究。限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)以及随机扩增片段长度多态性(ran-domam plified polymorphic DNA, RAPD)等方法已成为基因变异分析的有力工具。但这些方法或实验条件要求较高，操作比较繁琐，局限性较大。1989年Orita提出的单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)作为一种检测基因突变的方法, 经不断改进和完善, 更为简便、快速、灵敏, 可用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入。

1 SSCP技术的基本原理

在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中，单链DNA的迁移率除与DNA长度有关外，更主要决定于DNA单链所形成的空间构象，相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同，PCR产物经变性后进行DNA凝胶电泳时，每条单链处于一定的位置，靶DNA中若发生碱基缺失、插入或置换时，就会出现泳动变位，从而提示该片段的基因变异存在。该法自1989年首次报告以来，已广泛用于人类癌基因、抑癌基因和遗传病相关突变的快速检测。

       Amplified mutant and wild-type alleles of exon 8 from the p53 gene. Separation by SSCP run at a constant 30 W for 3.5 hours at 8 °C in 1x TBE on an 8% acrylamide/bis gel (37.5:1) with 3.5% glycerol. Lane 1, undenatured mutant allele; lane 2, mutant allele; lane 3, wild-type allele; lane 4, undenatured wild-type allele.

2 PCR-SSCP技术的优点

原理和操作简单，不需要特殊仪器，技术容易掌握；实验步骤少，周期短；成本低，所用试剂均价格低廉；可用非同位素法检测；适用于大样品筛选。在测序之间，如能采用本法筛选出所需测序的样品，可大大避免盲目测序带来的人力、物力和时间上的浪费，加快测序工作的进度。

3 PCR-SSCP技术的缺点

不能确定变异的位置，检测存在假阳性。单链DNA片段越小，检测的灵敏度越高。Orita认为SSCP能检出250~300bp DNA片段中一个碱基的变异；小于200bp的片段，检测70%的点突变；300bp片段，发现50%的突变；大于500bp，仅能检出10%~30%的点突变。Hayashi认为SSCP分析对于小于400bp的PCR产物最有效。

4 在植物病理学方面的应用

4.1 PCR-SSCP技术在植物病毒研究上的应用

PCR-SSCP技术除了在菌根真菌、柳锈菌以及少量的植物病毒的研究上有应用外，在植物病理学上的应用还较少。

4.1.1分子变异的研究 PCR-SSCP技术对于大样品量的植物病毒分离物，尤其是血清学技术难以区分的分子变异和株系分化的研究是一种理想的手段。

雷娟利等应用PCR-SSCP技术对来自我国不同地区的真菌传小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)分离物进行了分析，发现血清学技术难以区分的各分离物，其SSCP图谱有明显的差异。

施农农、Shietal对用血清学技术难以区分的我国及英国大麦黄花叶病毒(Barley yellow mosaic virus, BaYMV)各分离物的特定片段分别进行PCR-SSCP分析，并根据SSCP图谱的多态性断定我国及英国的BaYMV分离物都存在株系分化。

Rubioetal应用PCR-SSCP技术并结合生物学和血清学技术对柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)不同分离物的外壳蛋白(coatprotein, CP)基因进行分析，可有效地对CTV各分离物进行鉴定和分类。

Stavoloneetal对芜青花叶病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)不同分离物的CP基因的RT-PCR扩增产物经酶切后进行SSCP分析，发现各分离物的SSCP图谱存在多态性，从而认为TuMV存在分子变异，并将SSCP图谱与各分离物的生物学特性及血清学特性进行了比较，发现各分离物的SSCP泳动带型与血清学反应结果一致，但和其生物学特性存在一定的差异。

林含新等检测出我国水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV）6个分离物CP、SP基因序列间存在差异。

4.1.2混合侵染的检测应用PCR-SSCP技术可对虫传病毒同一区段序列的不同变异类型在昆虫介体体内的传毒特性进行快速检测。Sugaetal的研究结果发现，水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus, RRSV)第9片段RNA(segment9RNA,S9RNA)在843bp处存在一个碱基突变(A→C)，从而导致不同类型S9RNA序列的PCR-SSCP条带的泳动速度不同。另外，对昆虫介体体内和水稻病株内所分离到的病毒S9RNA分别进行PCR-SSCP分析，发现SSCP图谱可分成3类，其中有一类图谱的条带是另两类图谱的累加。因此，可根据这3类SSCP图谱对S9RNA在昆虫介体体内或在水稻体内是属于单独侵染还是混合侵染做出快速的判断。PCR-SSCP技术还可对病毒在被侵染的植物体内的不同部位的序列变异类型进行快速检测。Magomeetal对侵染苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)的病株的不同枝条上的叶片分离到的病毒的V区(有2-4nt的差异)进行RT-PCR扩增，再进行SSCP分析，并根据SSCP图谱中条带的数目来确定其序列变异的程度。结果发现，不同枝条上叶片的RT-PCR扩增片段的SSCP图谱各不相同，从而认为ASGV在被侵染的植物体内是由不同变异类型的序列以混合侵染的形式存在的，而且，序列变异的类型在各枝条叶片中的分布是不均匀的。

4.1.3分子流行病学应用PCR-SSCP技术对不同地区、不同田块、同一田块的不同位置、不同寄主以及不同年度间所分离到的病毒分离物基因片段的分子变异进行快速检测，并根据SSCP图谱在群体水平和分子水平上对这种病毒时空分布进行监测，这将为揭示其分子演化规律及分子流行病学提供依据。Koenigetal对采自不同国家的甜菜坏死黄脉病毒(Beet necrotic yellow vein virus, BNYVV)的不同基因组组分的特定片段经扩增后进行SSCP分析，并根据SSCP图谱将不同分离物划分为A、B、P3个株系群。其中SSCP图谱条带较少并仅发现于法国Pithirers地区的分离物称为P株系群，只发现于法国及德国部分地区的为B株系群，其余的则属于A株系群。古老的BNYVV由于在进化过程最有可能是失去而不是得到RNA区段，所以可推断认为P株系群有可能是一种比A、B株系群更古老的种类。另外，在英国某些地区发现的分离物的PCR-SSCP图谱的条带是A和B两类株系群图谱的累加，故可断定这类分离物是由其它地区传到英国引起混合侵染的结果。Mastarietal分别对从法国某地区不同寄主(黑麦草、大麦)上分离到的大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus, BYDV)PAV株系不同分离物的CP基因的RT-PCR扩增产物进行SSCP分析。结果发现，不同分离物的SSCP图谱可分成3类，其中有一类分离物的图谱是另两类图谱的累加，但这种序列变异类型与分离物的采集地并不相关，而与寄主植物的类型有密切相关。这说明了寄主植物的种类在BYDV和寄主的协同进化过程中起着重要的作用，为研究BYDV的分子流行病学提供了依据。

4.2 在线虫上的应用

张立海2002年对松材线虫rDNA进行PCR-SSCP分析，表明松材线虫和拟松材线虫种间差别明显；松材线虫ssDNA无种内差别，但拟松材线虫有种内差别。

5 PCR-SSCP技术的发展

SSCP技术自创立以来，经历了自身发展和完善的过程。刚建立时是将同位素渗入PCR扩增物中，通过放射自显影来显示结果，这给该技术的推广造成一定的困难。近年来利用银染和EB染色方法检测，使得该方法大大简化。现介绍几种改进的方法:

5.1 RNA-SSCP分析

其特点是RNA有着更多精细的二级和三级构象。这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高了检出率，其突变检出率可达90%以上。另外，RNA不易结合成双链，因此可以较大量地进行电泳，有利于用EB染色。Sarkaretal用RNA-SSCP分析对全长为2600bpDNA片段的20处碱基点突变进行检测，发现用RNA-SSCP分析可检测出其中的70%，而DNA-SSCP分析只能检测出35%，显示了RNA-SSCP分析比DNA-SSCP分析有更高的灵敏性。

5.2限制性内切酶指纹SSCP(restriction endonun-clease fingerprinting SSCP, REF-SSCP)分析

    用适当的限制性内切酶将长片段DNA酶解后再进行SSCP分析。REF-SSCP技术的建立，确保了1000bp片段内几乎所有突变的检测。1000bp含24个突变的DNA片段用5种限制性内切酶酶解后产生约150bp的片段再进行SSCP分析，发现检出率为96%（Liu等,1995）。

5.3双脱氧指纹(dideoxy fingerprinting, ddF)分析

PCR-SSCP技术与Sanger双脱氧测序法的联用。PCR扩增产物经Sanger双脱氧测序反应后，再进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。其特点是假阳性率较低，还可确定突变位点。双向双脱氧指纹(bi-directionalddF, Bi-ddF)分析，即PCR扩增产物从5′端及3′端两个方向进行测序后，再分别进行SSCP分析。其特点是可以确定分析序列内的所有突变位点。用此方法对494bp含有20个突变的DNA片段的检出率达到100%。

5.4单双链构象多态性(single-and double-strand conformation polymorphism, SDSCP)分析

其原理是自然复性的双链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶上与经变性后的单链DNA的泳动速度不同，同样会表现出多态型的泳动图谱。实验要求同一样品在电泳槽不同孔道分别上样，控制电泳时间。电泳时间较短的单条带为复性双链DNA，电泳时间较长的可以分开的为单链DNA。SDSCP分析可以避免由于2条单链带泳动带型相似而无法区分的情况。

5.5荧光标记PCR-SSCP(fluorescence-based PCR-SSCP, F-SSCP)分析

用经荧光标记的引物进行PCR扩增后在自动测序装置进行SSCP分析，由于可保证恒温，又可自动检测，故大大提高了检出率。多重荧光标记PCR-SSCP(multiple F-SSCP, MF-SSCP)分析是用不同颜色的荧光染料对PCR扩增产物进行标记，再用适当的内切酶进行酶切后在自动测序装置进行SSCP分析。由于可对双链DNA变性后的正、负性单链DNA分别进行荧光标记，所以这种方法除了可辨别单链的正、负性外，还可区分对由于2条单链DNA空间构象相似在非变性聚丙烯酰胺凝胶上无法分离开的带型作出检测，从而提高了检出率。

5.6毛细管电泳荧光标记PCR-SSCP(capillary based electrophoresis-FSSCP, CE-FSSCP)分析

检测灵敏度和自动化程度更高，也被发展用于检测p53癌基因点突变。为了进一步提高SSCP分析的检出率，可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合。其中与杂交双链(heterocluplex, Het)分析结合可以大大提高检出率。Het分析是用探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互补的杂交链在非变性聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳被分离开。对同一靶序列分别进行SSCP和Het分析可以使点突变的检出率接近100%，而且实验简便。

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